मायोसिन हेभी चेनभन्दा बाहिर मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको विषमता

nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईंले प्रयोग गरिरहनुभएको ब्राउजर संस्करणमा सीमित CSS समर्थन छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई नवीनतम ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम पार्नुहोस्)। थप रूपमा, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, यो साइट शैली र जाभास्क्रिप्टबाट मुक्त हुनेछ।
कंकाल मांसपेशी मुख्यतया मायोफिब्रिलहरू मिलेर बनेको एक विषम तन्तु हो, जुन मानवमा सामान्यतया तीन प्रकारमा वर्गीकृत गरिन्छ: एउटा "ढिलो" (प्रकार १) र दुई "छिटो" (प्रकार २ए र २एक्स)। यद्यपि, परम्परागत मायोफिब्रिल प्रकारहरू बीच र भित्र विषमता राम्रोसँग बुझिएको छैन। हामीले मानव भास्टस ल्याटरलिसबाट क्रमशः १०५० र १०३८ व्यक्तिगत मायोफिब्रिलहरूमा ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक दृष्टिकोणहरू लागू गर्यौं। प्रोटोमिक अध्ययनमा पुरुषहरू समावेश थिए, र ट्रान्सक्रिप्टोमिक अध्ययनमा १० पुरुष र २ महिलाहरू समावेश थिए। मायोसिन हेभी चेन आइसोफर्महरूको अतिरिक्त, हामीले मेटाबोलिक प्रोटीन, राइबोसोमल प्रोटीन, र सेलुलर जंक्शनल प्रोटीनहरूलाई बहुआयामिक इन्टरमायोफिब्रिल परिवर्तनशीलताको स्रोतको रूपमा पहिचान गर्यौं। यसबाहेक, ढिलो र छिटो फाइबरहरूको क्लस्टरहरूको पहिचानको बावजुद, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि प्रकार २एक्स फाइबरहरू अन्य फास्ट-ट्विच फाइबरहरूबाट फेनोटाइपिक रूपमा अविभाज्य छन्। यसबाहेक, नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा मायोफाइबर फेनोटाइप वर्णन गर्न मायोसिन हेभी चेन-आधारित वर्गीकरण अपर्याप्त छ। समग्रमा, हाम्रो डेटाले बहुआयामिक मायोफाइबर विषमता सुझाव दिन्छ, मायोसिन हेभी चेन आइसोफर्महरूभन्दा बाहिर फैलिएको भिन्नताका स्रोतहरू सहित।
कोशिका विषमता सबै जैविक प्रणालीहरूको एक अन्तर्निहित विशेषता हो, जसले कोषहरूलाई तन्तु र कोषहरूको विभिन्न आवश्यकताहरू पूरा गर्न विशेषज्ञता प्रदान गर्दछ।१ कंकाल मांसपेशी फाइबर विषमताको परम्परागत दृष्टिकोण यो रहेको छ कि मोटर न्यूरोनहरूले मोटर एकाइ भित्र फाइबर प्रकार परिभाषित गर्दछ, र त्यो फाइबर प्रकार (अर्थात्, मानवमा प्रकार १, प्रकार २A, र प्रकार २X) मायोसिन हेभी चेन (MYH) आइसोफर्महरूको विशेषताहरूद्वारा निर्धारण गरिन्छ।२ यो सुरुमा तिनीहरूको pH ATPase अस्थिरतामा आधारित थियो,३,४ र पछि तिनीहरूको MYH को आणविक अभिव्यक्तिमा।५ यद्यपि, "मिश्रित" फाइबरहरूको पहिचान र पछि स्वीकृति जसले विभिन्न अनुपातमा धेरै MYH हरूलाई सह-अभिव्यक्त गर्दछ, कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूलाई फरक फाइबर प्रकारहरूको रूपमा भन्दा निरन्तरताको रूपमा बढ्दो रूपमा हेरिन्छ।६ यसको बावजुद, क्षेत्र अझै पनि मायोफाइबर वर्गीकरणको लागि प्राथमिक वर्गीकरणकर्ताको रूपमा MYH मा धेरै निर्भर गर्दछ, प्रारम्भिक मुसा अध्ययनहरूको सीमितता र महत्त्वपूर्ण पूर्वाग्रहहरूबाट प्रभावित दृष्टिकोण जसको MYH अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरू र फाइबर प्रकारहरूको दायरा मानिसहरूमा भन्दा फरक छ।२ फरक मानव कंकाल मांसपेशीहरूले प्रदर्शन गर्ने तथ्यले परिस्थिति अझ जटिल छ। फाइबर प्रकारहरूको विविध दायरा।७ भास्टस लेटरालिस एक मिश्रित मांसपेशी हो जसमा मध्यवर्ती (र त्यसैले प्रतिनिधि) MYH अभिव्यक्ति प्रोफाइल हुन्छ।७ यसबाहेक, यसको नमूना लिने सहजताले यसलाई मानवहरूमा सबैभन्दा राम्रो अध्ययन गरिएको मांसपेशी बनाउँछ।
तसर्थ, शक्तिशाली "ओमिक्स" उपकरणहरू प्रयोग गरेर कंकाल मांसपेशी फाइबर विविधताको निष्पक्ष अनुसन्धान महत्वपूर्ण छ तर चुनौतीपूर्ण पनि छ, आंशिक रूपमा कंकाल मांसपेशी फाइबरको बहु-न्यूक्लिएटेड प्रकृतिको कारणले। यद्यपि, ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स8,9 र प्रोटियोमिक्स10 प्रविधिहरूले हालका वर्षहरूमा विभिन्न प्राविधिक प्रगतिहरूको कारणले संवेदनशीलतामा क्रान्ति गरेका छन्, जसले एकल-फाइबर रिजोल्युसनमा कंकाल मांसपेशीको विश्लेषणलाई अनुमति दिन्छ। फलस्वरूप, एकल-फाइबर विविधता र एट्रोफिक उत्तेजना र बुढ्यौलीमा तिनीहरूको प्रतिक्रियाको विशेषता निर्धारणमा महत्त्वपूर्ण प्रगति भएको छ11,12,13,14,15,16,17,18। महत्त्वपूर्ण रूपमा, यी प्राविधिक प्रगतिहरूमा क्लिनिकल अनुप्रयोगहरू छन्, जसले रोग-सम्बन्धित डिसरेगुलेसनको थप विस्तृत र सटीक विशेषताको लागि अनुमति दिन्छ। उदाहरणका लागि, सबैभन्दा सामान्य वंशाणुगत मांसपेशी रोगहरू मध्ये एक, नेमलाइन मायोप्याथीको प्याथोफिजियोलोजी (MIM 605355 र MIM 161800), जटिल र भ्रामक छ।19,20 त्यसैले, कंकाल मांसपेशी फाइबरको डिसरेगुलेसनको राम्रो विशेषताको कारणले यस रोगको हाम्रो बुझाइमा महत्त्वपूर्ण प्रगति हुन सक्छ।
हामीले मानव बायोप्सी नमूनाहरूबाट म्यानुअल रूपमा अलग गरिएको एकल कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक विश्लेषणको लागि विधिहरू विकास गर्यौं र तिनीहरूलाई हजारौं फाइबरहरूमा लागू गर्यौं, जसले हामीलाई मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको सेलुलर विषमता अनुसन्धान गर्न अनुमति दियो। यस कामको क्रममा, हामीले मांसपेशी फाइबरहरूको ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक फेनोटाइपिङको शक्ति प्रदर्शन गर्यौं र मेटाबोलिक, राइबोसोमल, र सेलुलर जंक्शनल प्रोटीनहरूलाई इन्टरफाइबर परिवर्तनशीलताको महत्त्वपूर्ण स्रोतको रूपमा पहिचान गर्यौं। यसबाहेक, यो प्रोटोमिक कार्यप्रवाह प्रयोग गरेर, हामीले एकल कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा नेमाटोड मायोप्याथीको क्लिनिकल प्रासंगिकतालाई चित्रण गर्यौं, MYH मा आधारित फाइबर प्रकारबाट स्वतन्त्र गैर-अक्सिडेटिभ फाइबरहरू तर्फ समन्वित परिवर्तन प्रकट गर्दै।
मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको विषमताको अनुसन्धान गर्न, हामीले एकल कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको ट्रान्सक्रिप्टोम र प्रोटियोम विश्लेषण सक्षम गर्न दुई कार्यप्रवाहहरू विकास गर्यौं (चित्र 1A र पूरक चित्र 1A)। हामीले नमूना भण्डारण र RNA र प्रोटीन अखण्डताको संरक्षणदेखि प्रत्येक दृष्टिकोणको लागि थ्रुपुट अनुकूलन गर्ने धेरै विधिगत चरणहरू विकास र अनुकूलित गर्यौं। ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणको लागि, यो रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनको प्रारम्भिक चरणमा नमूना-विशिष्ट आणविक बारकोडहरू सम्मिलित गरेर प्राप्त गरिएको थियो, कुशल डाउनस्ट्रीम प्रशोधनको लागि 96 फाइबरहरू जम्मा गर्न अनुमति दिँदै। परम्परागत एकल-कोशिका दृष्टिकोणहरूको तुलनामा गहिरो अनुक्रम (±1 मिलियन रिडहरू प्रति फाइबर) ले ट्रान्सक्रिप्टोम डेटालाई अझ समृद्ध बनायो। 21 प्रोटियोमिक्सको लागि, हामीले उच्च थ्रुपुट कायम राख्दै प्रोटियोम गहिराइलाई अनुकूलन गर्न timsTOF मास स्पेक्ट्रोमिटरमा DIA-PASEF डेटा अधिग्रहणसँग जोडिएको छोटो क्रोमेटोग्राफिक ग्रेडियन्ट (21 मिनेट) प्रयोग गर्यौं। २२,२३ स्वस्थ कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको विषमताको अनुसन्धान गर्न, हामीले १४ स्वस्थ वयस्क दाताहरूबाट १,०५० व्यक्तिगत फाइबरहरूको ट्रान्सक्रिप्टोमहरू र ५ स्वस्थ वयस्क दाताहरूबाट १,०३८ फाइबरहरूको प्रोटियोमहरूको चित्रण गर्यौं (पूरक तालिका १)। यस पेपरमा, यी डेटासेटहरूलाई क्रमशः १,०००-फाइबर ट्रान्सक्रिप्टोमहरू र प्रोटियोमहरू भनेर उल्लेख गरिएको छ। हाम्रो दृष्टिकोणले १,०००-फाइबर ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटियोमिक विश्लेषणहरूमा कुल २७,२३७ ट्रान्सक्रिप्टहरू र २,९८३ प्रोटीनहरू पत्ता लगायो (चित्र १A, पूरक डेटासेटहरू १-२)। प्रति फाइबरमा >१,००० पत्ता लगाइएका जीनहरू र ५०% मान्य मानहरूको लागि ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटियोमिक डेटासेटहरू फिल्टर गरेपछि, ट्रान्सक्रिप्टोम र प्रोटियोममा क्रमशः ९२५ र ९७४ फाइबरहरूको लागि पछिल्ला बायोइन्फर्मेटिक्स विश्लेषणहरू गरियो। फिल्टरिङ पछि, प्रति फाइबर औसत ४२५७ ± १५५७ जीन र २०१५ ± २३४ प्रोटिन (औसत ± SD) पत्ता लाग्यो, जसमा सीमित अन्तर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता थियो (पूरक चित्र १B–C, पूरक डेटासेट ३–४)। यद्यपि, सहभागीहरूमा भित्र-विषय परिवर्तनशीलता बढी स्पष्ट थियो, सम्भवतः विभिन्न लम्बाइ र क्रस-सेक्शनल क्षेत्रहरूका फाइबरहरू बीच RNA/प्रोटिन उपजमा भिन्नताहरूको कारणले। धेरैजसो प्रोटिनहरू (>२०००) को लागि, भिन्नताको गुणांक २०% भन्दा कम थियो (पूरक चित्र १D)। दुबै विधिहरूले मांसपेशी संकुचनका लागि महत्त्वपूर्ण उच्च अभिव्यक्त हस्ताक्षरहरू (जस्तै, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (पूरक चित्र १E–F) भएका ट्रान्सक्रिप्टहरू र प्रोटिनहरूको विस्तृत गतिशील दायरा क्याप्चर गर्न अनुमति दिए। धेरैजसो पहिचान गरिएका विशेषताहरू ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक डेटासेटहरू बीच सामान्य थिए (पूरक चित्र १G), र यी विशेषताहरूको औसत UMI/LFQ तीव्रताहरू उचित रूपमा राम्रोसँग सहसम्बन्धित थिए (r = ०.५२) (पूरक चित्र १H)।
ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र प्रोटियोमिक्स कार्यप्रवाह (BioRender.com मार्फत सिर्जना गरिएको)। MYH7, MYH2, र MYH1 को लागि BD गतिशील दायरा वक्रहरू, र फाइबर प्रकार असाइनमेन्टको लागि गणना गरिएको थ्रेसहोल्डहरू। ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र प्रोटियोमिक्स डेटासेटहरूमा फाइबरहरूमा MYH अभिव्यक्तिको E, F वितरण। MYH-आधारित फाइबर प्रकारद्वारा रंगिएको ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र प्रोटियोमिक्सको लागि G, H एकरूप विविधता अनुमान र प्रक्षेपण (UMAP) प्लटहरू। ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र प्रोटियोमिक्स डेटासेटहरूमा MYH7, MYH2, र MYH1 अभिव्यक्ति देखाउने I, J फीचर प्लटहरू।
हामीले सुरुमा ओमिक्स डेटासेटहरूमा MYH अभिव्यक्तिको उच्च संवेदनशीलता र गतिशील दायराको फाइदा लिने अनुकूलित दृष्टिकोण प्रयोग गरेर प्रत्येक फाइबरमा MYH-आधारित फाइबर प्रकार तोक्ने निर्णय गर्यौं। अघिल्ला अध्ययनहरूले विभिन्न MYHs11,14,24 को अभिव्यक्तिको निश्चित प्रतिशतको आधारमा शुद्ध प्रकार 1, प्रकार 2A, प्रकार 2X, वा मिश्रित रूपमा फाइबरहरूलाई लेबल गर्न मनमानी थ्रेसहोल्डहरू प्रयोग गरेका छन्। हामीले फरक दृष्टिकोण प्रयोग गर्यौं जसमा प्रत्येक फाइबरको अभिव्यक्तिलाई हामीले फाइबरहरू टाइप गर्न प्रयोग गर्ने MYHs द्वारा क्रमबद्ध गरिएको थियो: MYH7, MYH2, र MYH1, क्रमशः प्रकार 1, प्रकार 2A, र प्रकार 2X फाइबरहरूसँग मेल खान्छ। त्यसपछि हामीले गणितीय रूपमा प्रत्येक परिणामस्वरूप वक्रको तल्लो इन्फ्लेक्सन बिन्दु गणना गर्यौं र प्रत्येक MYH (चित्र 1B-D) को लागि फाइबरहरूलाई सकारात्मक (थ्रेसहोल्ड माथि) वा नकारात्मक (थ्रेसहोल्ड तल) को रूपमा तोक्न थ्रेसहोल्डको रूपमा प्रयोग गर्यौं। यी तथ्याङ्कहरूले देखाउँछन् कि MYH7 (चित्र 1B) र MYH2 (चित्र 1C) मा प्रोटीन स्तरको तुलनामा RNA स्तरमा बढी फरक अन/अफ अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरू छन्। वास्तवमा, प्रोटीन स्तरमा, धेरै कम फाइबरहरूले MYH7 व्यक्त गरेनन्, र कुनै पनि फाइबरमा 100% MYH2 अभिव्यक्ति थिएन। हामीले त्यसपछि प्रत्येक डेटासेटमा सबै फाइबरहरूमा MYH-आधारित फाइबर प्रकारहरू तोक्न पूर्वनिर्धारित अभिव्यक्ति थ्रेसहोल्डहरू प्रयोग गर्यौं। उदाहरणका लागि, MYH7+/MYH2-/MYH1- फाइबरहरूलाई प्रकार 1 मा तोकिएको थियो, जबकि MYH7-/MYH2+/MYH1+ फाइबरहरूलाई मिश्रित प्रकार 2A/2X मा तोकिएको थियो (पूर्ण विवरणको लागि पूरक तालिका 2 हेर्नुहोस्)। सबै फाइबरहरूलाई एकत्रित गर्दै, हामीले RNA (चित्र 1E) र प्रोटीन (चित्र 1F) दुवै स्तरहरूमा MYH-आधारित फाइबर प्रकारहरूको उल्लेखनीय रूपमा समान वितरण अवलोकन गर्यौं, जबकि MYH-आधारित फाइबर प्रकारहरूको सापेक्ष संरचना व्यक्तिहरूमा भिन्न थियो, अपेक्षा गरिए अनुसार (पूरक चित्र 2A)। धेरैजसो फाइबरहरूलाई शुद्ध प्रकार १ (३४–३५%) वा प्रकार २ए (३६–३८%) को रूपमा वर्गीकृत गरिएको थियो, यद्यपि मिश्रित प्रकार २ए/२एक्स फाइबरहरूको उल्लेखनीय संख्या पनि पत्ता लगाइएको थियो (१६–१९%)। एउटा उल्लेखनीय भिन्नता यो हो कि शुद्ध प्रकार २एक्स फाइबरहरू केवल आरएनए स्तरमा पत्ता लगाउन सकिन्छ, तर प्रोटीन स्तरमा होइन, जसले सुझाव दिन्छ कि द्रुत MYH अभिव्यक्ति कम्तिमा आंशिक रूपमा पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनली नियमन गरिएको छ।
हामीले एन्टिबडी-आधारित डट ब्लटिंग प्रयोग गरेर हाम्रो प्रोटियोमिक्स-आधारित MYH फाइबर टाइपिङ विधिलाई प्रमाणित गर्यौं, र दुवै विधिहरूले शुद्ध प्रकार 1 र प्रकार 2A फाइबरहरू पहिचान गर्न 100% सहमति हासिल गरे (पूरक चित्र 2B हेर्नुहोस्)। यद्यपि, प्रोटियोमिक्स-आधारित दृष्टिकोण अधिक संवेदनशील थियो, मिश्रित फाइबरहरू पहिचान गर्न र प्रत्येक फाइबरमा प्रत्येक MYH जीनको अनुपात परिमाण गर्न बढी कुशल थियो। यी डेटाले कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकारहरू चित्रण गर्न वस्तुनिष्ठ, अत्यधिक संवेदनशील ओमिक्स-आधारित दृष्टिकोण प्रयोग गर्ने प्रभावकारिता प्रदर्शन गर्दछ।
त्यसपछि हामीले ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स र प्रोटियोमिक्स द्वारा प्रदान गरिएको संयुक्त जानकारी प्रयोग गर्यौं जसले मायोफाइबरहरूलाई तिनीहरूको पूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम वा प्रोटियोमको आधारमा वस्तुनिष्ठ रूपमा वर्गीकृत गर्‍यो। छ प्रमुख घटकहरूमा आयाम घटाउन एकरूप मेनिफोल्ड अनुमान र प्रक्षेपण (UMAP) विधि प्रयोग गरेर, हामी ट्रान्सक्रिप्टोम (चित्र 1G) र प्रोटियोम (चित्र 1H) मा मायोफाइबर परिवर्तनशीलता कल्पना गर्न सक्षम भयौं। उल्लेखनीय रूपमा, मायोफाइबरहरूलाई सहभागीहरू (पूरक चित्र 3C-D) वा ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स वा प्रोटियोमिक्स डेटासेटहरूमा परीक्षण दिनहरू (पूरक चित्र 3E) द्वारा समूहबद्ध गरिएको थिएन, जसले सुझाव दिन्छ कि कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा भित्र-विषय परिवर्तनशीलता विषय-विषय परिवर्तनशीलता भन्दा बढी छ। UMAP प्लटमा, "छिटो" र "ढिलो" मायोफाइबरहरू प्रतिनिधित्व गर्ने दुई फरक क्लस्टरहरू देखा परे (चित्र 1G-H)। MYH7+ (ढिलो) मायोफाइबरहरू UMAP1 को सकारात्मक ध्रुवमा क्लस्टर गरिएका थिए, जबकि MYH2+ र MYH1+ (छिटो) मायोफाइबरहरू UMAP1 को नकारात्मक ध्रुवमा क्लस्टर गरिएका थिए (चित्रहरू 1I–J)। यद्यपि, MYH अभिव्यक्तिको आधारमा फास्ट-ट्विच फाइबर प्रकारहरू (जस्तै, प्रकार 2A, प्रकार 2X, वा मिश्रित 2A/2X) बीच कुनै भिन्नता गरिएको थिएन, जसले सुझाव दिन्छ कि MYH1 (चित्र 1I–J) वा अन्य शास्त्रीय 2X मायोफाइबर मार्करहरू जस्तै ACTN3 वा MYLK2 (पूरक चित्रहरू 4A–B) अभिव्यक्तिले सम्पूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम वा प्रोटियोमलाई विचार गर्दा विभिन्न मायोफाइबर प्रकारहरू बीच भिन्नता गर्दैन। यसबाहेक, MYH2 र MYH7 को तुलनामा, केही ट्रान्सक्रिप्टहरू वा प्रोटीनहरू MYH1 (पूरक चित्रहरू 4C–H) सँग सकारात्मक रूपमा सहसम्बन्धित थिए, जसले सुझाव दिन्छ कि MYH1 प्रशस्तताले मायोफाइबर ट्रान्सक्रिप्टोम/प्रोटियोमलाई पूर्ण रूपमा प्रतिबिम्बित गर्दैन। UMAP स्तरमा तीन MYH आइसोफर्महरूको मिश्रित अभिव्यक्तिको मूल्याङ्कन गर्दा समान निष्कर्षमा पुगेका थिए (पूरक चित्र 4I–J)। यसरी, MYH परिमाणीकरणको आधारमा ट्रान्सक्रिप्ट स्तरमा 2X फाइबरहरू पहिचान गर्न सकिन्छ, तर सम्पूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम वा प्रोटियोमलाई विचार गर्दा MYH1+ फाइबरहरू अन्य द्रुत फाइबरहरूबाट छुट्याउन सकिँदैन।
MYH भन्दा बाहिर ढिलो फाइबर विषमताको प्रारम्भिक अन्वेषणको रूपमा, हामीले चार स्थापित ढिलो फाइबर प्रकार-विशिष्ट प्रोटीनहरूको मूल्याङ्कन गर्यौं: TPM3, TNNT1, MYL3, र ATP2A22। ढिलो फाइबर उपप्रकारहरूले ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स (पूरक चित्र 5A) र प्रोटियोमिक्स (पूरक चित्र 5B) दुवैमा MYH7 सँग उच्च, यद्यपि पूर्ण नभए पनि, पियर्सन सहसम्बन्ध देखाए। ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स (पूरक चित्र 5C) र प्रोटियोमिक्स (पूरक चित्र 5D) मा क्रमशः सबै जीन/प्रोटिन उपप्रकारहरूद्वारा लगभग 25% र 33% ढिलो फाइबरहरूलाई शुद्ध ढिलो फाइबरको रूपमा वर्गीकृत गरिएको थिएन। त्यसकारण, बहु जीन/प्रोटिन उपप्रकारहरूमा आधारित ढिलो फाइबर वर्गीकरणले फाइबर प्रकार-विशिष्ट भनेर चिनिने प्रोटीनहरूको लागि पनि अतिरिक्त जटिलता प्रस्तुत गर्दछ। यसले सुझाव दिन्छ कि एकल जीन/प्रोटिन परिवारको आइसोफर्महरूमा आधारित फाइबर वर्गीकरणले कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको वास्तविक विषमतालाई पर्याप्त रूपमा प्रतिबिम्बित नगर्न सक्छ।
सम्पूर्ण ओमिक्स मोडेलको स्केलमा मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको फेनोटाइपिक परिवर्तनशीलतालाई थप अन्वेषण गर्न, हामीले प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) (चित्र 2A) प्रयोग गरेर डेटाको निष्पक्ष आयाम घटाउने प्रदर्शन गर्यौं। UMAP प्लटहरू जस्तै, न त सहभागीले न त परीक्षण दिनले PCA स्तरमा फाइबर क्लस्टरिङलाई प्रभाव पारे (पूरक चित्रहरू 6A–C)। दुबै डेटासेटहरूमा, MYH-आधारित फाइबर प्रकार PC2 द्वारा व्याख्या गरिएको थियो, जसले ढिलो-ट्विच प्रकार 1 फाइबरहरूको क्लस्टर र फास्ट-ट्विच प्रकार 2A, प्रकार 2X, र मिश्रित 2A/2X फाइबरहरू भएको दोस्रो क्लस्टर देखाएको थियो (चित्र 2A)। दुबै डेटासेटहरूमा, यी दुई क्लस्टरहरू थोरै संख्यामा मिश्रित प्रकार 1/2A फाइबरहरूद्वारा जोडिएका थिए। अपेक्षा गरिए अनुसार, मुख्य PC ड्राइभरहरूको अत्यधिक प्रतिनिधित्व विश्लेषणले पुष्टि गर्‍यो कि PC2 संकुचन र मेटाबोलिक हस्ताक्षरहरू द्वारा संचालित थियो (चित्र 2B र पूरक चित्रहरू 6D–E, पूरक डेटासेटहरू 5–6)। समग्रमा, MYH-आधारित फाइबर प्रकार PC2 सँग निरन्तर भिन्नता व्याख्या गर्न पर्याप्त पाइयो, तथाकथित 2X फाइबरहरू बाहेक जुन द्रुत क्लस्टर भित्र ट्रान्सक्रिप्टोमभरि वितरित गरिएको थियो।
A. MYH मा आधारित फाइबर प्रकार अनुसार रंगीन ट्रान्सक्रिप्टोम र प्रोटीओम डेटासेटहरूको प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लटहरू। B. PC2 र PC1 मा ट्रान्सक्रिप्ट र प्रोटीन ड्राइभरहरूको संवर्धन विश्लेषण। क्लस्टर प्रोफाइलर प्याकेज र बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मानहरू प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय विश्लेषण गरिएको थियो। C, D. प्रोटीओममा ट्रान्सक्रिप्टोम र कोस्टामेर GO सर्तहरूमा इन्टरसेलुलर आसंजन जीन ओन्टोलोजी (GO) सर्तहरू अनुसार रंगीन PCA प्लटहरू। तीरहरूले ट्रान्सक्रिप्ट र प्रोटीन ड्राइभरहरू र तिनीहरूको दिशाहरू प्रतिनिधित्व गर्दछ। E, F. एकरूप मेनिफोल्ड अनुमान र प्रक्षेपण (UMAP) ले ढिलो/छिटो फाइबर प्रकारबाट स्वतन्त्र अभिव्यक्ति ग्रेडियन्टहरू देखाउने क्लिनिकली सान्दर्भिक सुविधाहरूको प्लटहरू सुविधा दिन्छ। G, H. ट्रान्सक्रिप्टोम र प्रोटीओमहरूमा PC2 र PC1 ड्राइभरहरू बीचको सहसम्बन्ध।
अप्रत्याशित रूपमा, MYH-आधारित मायोफाइबर प्रकारले परिवर्तनशीलताको दोस्रो उच्चतम डिग्री (PC2) मात्र व्याख्या गर्‍यो, जसले सुझाव दिन्छ कि MYH-आधारित मायोफाइबर प्रकार (PC1) सँग सम्बन्धित अन्य जैविक कारकहरूले कंकाल मांसपेशी फाइबर विषमतालाई नियमन गर्न महत्त्वपूर्ण भूमिका खेल्छन्। PC1 मा शीर्ष चालकहरूको अत्यधिक प्रतिनिधित्व विश्लेषणले PC1 मा परिवर्तनशीलता मुख्यतया ट्रान्सक्रिप्टोममा सेल-सेल आसंजन र राइबोसोम सामग्री, र प्रोटियोममा कोस्टामेर र राइबोसोमल प्रोटीनहरू द्वारा निर्धारण गरिएको थियो (चित्र 2B र पूरक चित्रहरू 6D-E, पूरक डेटा सेट 7)। कंकाल मांसपेशीमा, कोस्टामेरहरूले Z-डिस्कलाई सार्कोलेमामा जडान गर्छन् र बल प्रसारण र संकेतनमा संलग्न हुन्छन्। 25 एनोटेटेड PCA प्लटहरूले सेल-सेल आसंजन (ट्रान्सक्रिप्टोम, चित्र 2C) र कोस्टामेर (प्रोटियोम, चित्र 2D) सुविधाहरू प्रयोग गरेर PC1 मा बलियो बायाँ शिफ्ट प्रकट गर्‍यो, जसले संकेत गर्दछ कि यी सुविधाहरू निश्चित फाइबरहरूमा समृद्ध छन्।
UMAP स्तरमा मायोफाइबर क्लस्टरिङको थप विस्तृत परीक्षणले पत्ता लगायो कि धेरैजसो सुविधाहरूले मायोफाइबर सबक्लस्टर-विशिष्टको सट्टा मायोफाइबर प्रकार-स्वतन्त्र MYH-आधारित अभिव्यक्ति ग्रेडियन्ट प्रदर्शन गरे। यो निरन्तरता रोगविज्ञान अवस्थाहरूसँग सम्बन्धित धेरै जीनहरूको लागि अवलोकन गरिएको थियो (चित्र 2E), जस्तै CHCHD10 (न्यूरोमस्कुलर रोग), SLIT3 (मांसपेशी शोष), CTDNEP1 (मांसपेशी रोग)। यो निरन्तरता प्रोटीओममा पनि अवलोकन गरिएको थियो, जसमा न्यूरोलोजिकल विकारहरू (UGDH), इन्सुलिन सिग्नलिंग (PHIP), र ट्रान्सक्रिप्शन (HIST1H2AB) (चित्र 2F) सँग सम्बन्धित प्रोटीनहरू समावेश छन्। सामूहिक रूपमा, यी डेटाले विभिन्न मायोफाइबरहरूमा फाइबर प्रकार-स्वतन्त्र ढिलो/छिटो ट्विच विषमतामा निरन्तरतालाई संकेत गर्दछ।
चाखलाग्दो कुरा के छ भने, PC2 मा चालक जीनहरूले राम्रो ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटियोम सहसम्बन्ध (r = 0.663) (चित्र 2G) देखाए, जसले सुझाव दिन्छ कि ढिलो र छिटो-ट्विच फाइबर प्रकारहरू, र विशेष गरी कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको संकुचन र मेटाबोलिक गुणहरू, ट्रान्सक्रिप्शनली रूपमा नियमन गरिन्छ। यद्यपि, PC1 मा चालक जीनहरूले कुनै ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटियोम सहसम्बन्ध (r = -0.027) (चित्र 2H) देखाएनन्, जसले सुझाव दिन्छ कि ढिलो/छिटो-ट्विच फाइबर प्रकारहरूसँग असंबद्ध भिन्नताहरू धेरै हदसम्म पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनली रूपमा नियमन गरिन्छ। किनभने PC1 मा भिन्नताहरू मुख्यतया राइबोसोमल जीन ओन्टोलोजी सर्तहरू द्वारा व्याख्या गरिएको थियो, र राइबोसोमहरूले प्रोटीन अनुवादमा सक्रिय रूपमा भाग लिएर र प्रभाव पारेर कोशिकामा महत्त्वपूर्ण र विशेष भूमिका खेल्छन्, 31 हामी अर्को यो अप्रत्याशित राइबोसोमल विषमताको अनुसन्धान गर्न निस्कियौं।
हामीले पहिले GOCC शब्द "साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम" (चित्र 3A) मा प्रोटीनको सापेक्षिक प्रशस्तता अनुसार प्रोटियोमिक्स प्रमुख घटक विश्लेषण प्लटलाई रंग्यौं। यद्यपि यो शब्द PC1 को सकारात्मक पक्षमा समृद्ध छ, जसको परिणामस्वरूप सानो ग्रेडियन्ट हुन्छ, राइबोसोमल प्रोटीनहरूले PC1 को दुबै दिशामा विभाजन चलाउँछन् (चित्र 3A)। PC1 को नकारात्मक पक्षमा समृद्ध रिबोसोमल प्रोटीनहरूमा RPL18, RPS18, र RPS13 (चित्र 3B) समावेश थिए, जबकि RPL31, RPL35, र RPL38 (चित्र 3C) PC1 को सकारात्मक पक्षमा मुख्य चालकहरू थिए। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, RPL38 र RPS13 अन्य तन्तुहरूको तुलनामा कंकाल मांसपेशीमा अत्यधिक व्यक्त गरिएको थियो (पूरक चित्र 7A)। PC1 मा यी विशिष्ट राइबोसोमल हस्ताक्षरहरू ट्रान्सक्रिप्टोम (पूरक चित्र 7B) मा अवलोकन गरिएको थिएन, जसले पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनलाई संकेत गर्दछ।
A. प्रोटियोमभरि साइटोप्लाज्मिक राइबोसोमल जीन ओन्टोलोजी (GO) सर्तहरू अनुसार रंगिएको प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लट। तीरहरूले PCA प्लटमा प्रोटीन-मध्यस्थता भिन्नताको दिशालाई संकेत गर्दछ। रेखा लम्बाइ दिइएको प्रोटीनको लागि प्रमुख घटक स्कोरसँग मेल खान्छ। B, C. RPS13 र RPL38 को लागि PCA सुविधा प्लटहरू। D. साइटोप्लाज्मिक राइबोसोमल प्रोटीनहरूको असुरक्षित पदानुक्रमित क्लस्टरिङ विश्लेषण। E. कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा फरक प्रचुरता भएका राइबोसोमल प्रोटीनहरू हाइलाइट गर्ने 80S राइबोसोम (PDB: 4V6X) को संरचनात्मक मोडेल। F. mRNA निकास च्यानल नजिकै स्थानीयकृत विभिन्न स्टोइचियोमेट्री भएका रिबोसोमल प्रोटीनहरू।
राइबोसोमल हेटेरोजेनिटी र विशेषज्ञताको अवधारणा पहिले नै प्रस्ताव गरिएको छ, जसद्वारा विशिष्ट राइबोसोमल उप-जनसंख्या (राइबोसोमल हेटेरोजेनिटी) को उपस्थितिले विशिष्ट mRNA ट्रान्सक्रिप्ट पूलहरू34 (राइबोसोमल विशेषज्ञता) को चयनात्मक अनुवाद मार्फत विभिन्न तन्तुहरू32 र कोषहरू33 मा प्रोटीन अनुवादलाई प्रत्यक्ष रूपमा प्रभाव पार्न सक्छ। कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा सह-अभिव्यक्त राइबोसोमल प्रोटीनहरूको उप-जनसंख्या पहिचान गर्न, हामीले प्रोटियोममा राइबोसोमल प्रोटीनहरूको एक असुरक्षित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण गर्यौं (चित्र 3D, पूरक डेटा सेट 8)। अपेक्षा गरिए अनुसार, राइबोसोमल प्रोटीनहरू MYH मा आधारित फाइबर प्रकारद्वारा क्लस्टर भएनन्। यद्यपि, हामीले राइबोसोमल प्रोटीनहरूको तीन फरक क्लस्टरहरू पहिचान गर्यौं; पहिलो क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_1) RPL38 सँग सह-नियमित छ र त्यसैले सकारात्मक PC1 प्रोफाइल भएको फाइबरहरूमा अभिव्यक्ति बढेको छ। दोस्रो क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_2) RPS13 सँग सह-नियमित छ र नकारात्मक PC1 प्रोफाइल भएको फाइबरहरूमा उन्नत छ। तेस्रो क्लस्टर (ribosomal_cluster_3) ले कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा समन्वित भिन्नता अभिव्यक्ति देखाउँदैन र यसलाई "कोर" कंकाल मांसपेशी राइबोसोमल प्रोटीन मान्न सकिन्छ। दुबै राइबोसोमल क्लस्टर १ र २ मा राइबोसोमल प्रोटीनहरू छन् जुन पहिले वैकल्पिक अनुवाद (जस्तै, RPL10A, RPL38, RPS19, र RPS25) लाई नियमन गर्ने र विकासलाई कार्यात्मक रूपमा प्रभाव पार्ने देखाइएको छ (जस्तै, RPL10A, RPL38)।34,35,36,37,38 PCA परिणामहरूसँग मिल्दोजुल्दो, फाइबरहरूमा यी राइबोसोमल प्रोटीनहरूको अवलोकन गरिएको विषम प्रतिनिधित्वले पनि निरन्तरता देखायो (पूरक चित्र 7C)।
राइबोसोम भित्र विषम राइबोसोमल प्रोटीनहरूको स्थान कल्पना गर्न, हामीले मानव 80S राइबोसोम (प्रोटिन डाटा बैंक: 4V6X) (चित्र 3E) को संरचनात्मक मोडेल प्रयोग गर्यौं। विभिन्न राइबोसोमल क्लस्टरहरूसँग सम्बन्धित राइबोसोमल प्रोटीनहरूलाई अलग गरेपछि, तिनीहरूको स्थानहरू नजिकबाट पङ्क्तिबद्ध थिएनन्, जसले सुझाव दिन्छ कि हाम्रो दृष्टिकोणले राइबोसोमको निश्चित क्षेत्रहरू/अंशहरूको लागि संवर्धन प्रदान गर्न असफल भयो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, क्लस्टर 2 मा ठूला सबयुनिट प्रोटीनहरूको अनुपात क्लस्टर 1 र 3 (पूरक चित्र 7D) भन्दा कम थियो। हामीले अवलोकन गर्यौं कि कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा परिवर्तन गरिएको स्टोइचियोमेट्री भएका प्रोटीनहरू मुख्यतया राइबोसोम सतह (चित्र 3E) मा स्थानीयकृत थिए, विभिन्न mRNA जनसंख्यामा आन्तरिक राइबोसोम प्रविष्टि साइट (IRES) तत्वहरूसँग अन्तर्क्रिया गर्ने क्षमतासँग मेल खान्छ, जसले गर्दा चयनात्मक अनुवाद समन्वय गर्दछ। 40, 41 यसबाहेक, कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा परिवर्तन गरिएको स्टोइचियोमेट्री भएका धेरै प्रोटीनहरू mRNA निकास सुरुङ (चित्र 3F) जस्ता कार्यात्मक क्षेत्रहरू नजिक अवस्थित थिए, जसले चयनात्मक रूपमा अनुवादात्मक लम्बाइ र विशिष्ट पेप्टाइडहरूको गिरफ्तारीलाई नियमन गर्दछ। ४२ संक्षेपमा, हाम्रो तथ्याङ्कले सुझाव दिन्छ कि कंकाल मांसपेशी राइबोसोमल प्रोटीनहरूको स्टोइचियोमेट्रीले विषमता प्रदर्शन गर्दछ, जसले गर्दा कंकाल मांसपेशी फाइबरहरू बीच भिन्नता हुन्छ।
हामी अर्को पटक फास्ट- र स्लो-ट्विच फाइबर हस्ताक्षरहरू पहिचान गर्न र तिनीहरूको ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनको संयन्त्रहरू अन्वेषण गर्न निस्कियौं। दुई डेटासेटहरूमा UMAP द्वारा परिभाषित फास्ट- र स्लो-ट्विच फाइबर क्लस्टरहरूको तुलना गर्दै (चित्रहरू 1G-H र 4A-B), ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक विश्लेषणहरूले क्रमशः 1366 र 804 भिन्न रूपमा प्रचुर सुविधाहरू पहिचान गरे (चित्रहरू 4A-B, पूरक डेटासेटहरू 9-12)। हामीले सार्कोमेरहरू (जस्तै, ट्रोपोमायोसिन र ट्रोपोनिन), उत्तेजना-संकुचन युग्मन (SERCA आइसोफर्महरू), र ऊर्जा चयापचय (जस्तै, ALDOA र CKB) सँग सम्बन्धित हस्ताक्षरहरूमा अपेक्षित भिन्नताहरू अवलोकन गर्यौं। यसबाहेक, प्रोटीन युबिक्विटिनेशनलाई नियमन गर्ने ट्रान्सक्रिप्टहरू र प्रोटीनहरू द्रुत- र स्लो-ट्विच फाइबरहरूमा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका थिए (जस्तै, USP54, SH3RF2, USP28, र USP48) (चित्रहरू 4A-B)। यसबाहेक, माइक्रोबियल प्रोटीन जीन RP11-451G4.2 (DWORF), जुन पहिले भेडाको मांसपेशी फाइबर प्रकारहरूमा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएको देखाइएको छ र कार्डियक मांसपेशीमा SERCA गतिविधि बढाउँछ44, ढिलो कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा उल्लेखनीय रूपमा अपरेगुलेट गरिएको थियो (चित्र 4A)। त्यस्तै गरी, व्यक्तिगत फाइबर स्तरमा, मेटाबोलिज्म-सम्बन्धित ल्याक्टेट डिहाइड्रोजनेज आइसोफर्महरू (LDHA र LDHB, चित्र 4C र पूरक चित्र 8A) जस्ता ज्ञात हस्ताक्षरहरूमा महत्त्वपूर्ण भिन्नताहरू अवलोकन गरिएको थियो45,46 साथै पहिले अज्ञात फाइबर-प्रकार-विशिष्ट हस्ताक्षरहरू (जस्तै IRX3, USP54, USP28, र DPYSL3) (चित्र 4C)। ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटियोमिक डेटासेटहरू (पूरक चित्र 8B) बीच भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका सुविधाहरूको महत्त्वपूर्ण ओभरल्याप थियो, साथै मुख्यतया सार्कोमेरे सुविधाहरूको अधिक स्पष्ट भिन्न अभिव्यक्तिद्वारा संचालित फोल्ड परिवर्तन सहसम्बन्ध थियो (पूरक चित्र 8C)। उल्लेखनीय रूपमा, केही हस्ताक्षरहरू (जस्तै USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ले प्रोटोमिक स्तरमा मात्र बलियो पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन देखायो र ढिलो/छिटो ट्विच फाइबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरू थिए (पूरक चित्र 8C)।
चित्र १G–H मा एकरूप मेनिफोल्ड अनुमान र प्रक्षेपण (UMAP) प्लटहरू द्वारा पहिचान गरिएका ढिलो र छिटो क्लस्टरहरूको तुलना गर्ने A र B ज्वालामुखी प्लटहरू। रंगीन थोप्लाहरूले FDR < ०.०५ मा उल्लेखनीय रूपमा फरक हुने ट्रान्सक्रिप्टहरू वा प्रोटीनहरू प्रतिनिधित्व गर्छन्, र गाढा थोप्लाहरूले लग परिवर्तन > १ मा उल्लेखनीय रूपमा फरक हुने ट्रान्सक्रिप्टहरू वा प्रोटीनहरू प्रतिनिधित्व गर्छन्। दुई-तर्फी सांख्यिकीय विश्लेषण बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजित p मानहरू (ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स) वा लिम्मा रेखीय मोडेल विधि प्रयोग गरेर अनुभवजन्य बायेसियन विश्लेषणको साथ DESeq2 वाल्ड परीक्षण प्रयोग गरेर गरिएको थियो र त्यसपछि धेरै तुलनाहरू (प्रोटोमिक्स) को लागि बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजन गरिएको थियो। C ढिलो र छिटो फाइबरहरू बीच चयन गरिएका भिन्न रूपमा व्यक्त जीन वा प्रोटीनहरूको हस्ताक्षर प्लटहरू। D उल्लेखनीय रूपमा भिन्न रूपमा व्यक्त ट्रान्सक्रिप्टहरू र प्रोटीनहरूको संवर्धन विश्लेषण। ओभरल्यापिङ मानहरू दुवै डेटासेटहरूमा समृद्ध हुन्छन्, ट्रान्सक्रिप्टोम मानहरू ट्रान्सक्रिप्टोममा मात्र समृद्ध हुन्छन्, र प्रोटीओम मानहरू प्रोटीओममा मात्र समृद्ध हुन्छन्। तथ्याङ्कीय विश्लेषण बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजित p मानहरू सहित क्लस्टर प्रोफाइलर प्याकेज प्रयोग गरेर गरिएको थियो। E. SCENIC-व्युत्पन्न नियामक विशिष्टता स्कोर र फाइबर प्रकारहरू बीचको भिन्न mRNA अभिव्यक्तिको आधारमा SCENIC द्वारा पहिचान गरिएको फाइबर प्रकार-विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू। F. ढिलो र छिटो फाइबरहरू बीच भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका चयन गरिएका ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरूको प्रोफाइलिङ।
त्यसपछि हामीले भिन्न रूपमा प्रतिनिधित्व गरिएका जीन र प्रोटीनहरूको अत्यधिक प्रतिनिधित्व विश्लेषण गर्यौं (चित्र 4D, पूरक डेटा सेट 13)। दुई डेटासेटहरू बीच भिन्नता भएका सुविधाहरूको लागि मार्ग संवर्धनले अपेक्षित भिन्नताहरू प्रकट गर्‍यो, जस्तै फ्याटी एसिड β-अक्सिडेशन र केटोन मेटाबोलिज्म प्रक्रियाहरू (ढिलो फाइबर), मायोफिलामेन्ट/मांसपेशी संकुचन (क्रमशः द्रुत र ढिलो फाइबर), र कार्बोहाइड्रेट क्याटाबोलिक प्रक्रियाहरू (द्रुत फाइबर)। सेरिन/थ्रोनिन प्रोटीन फस्फेटेज गतिविधि पनि द्रुत फाइबरहरूमा बढाइएको थियो, जुन नियामक र उत्प्रेरक फस्फेटेज सबयुनिटहरू (PPP3CB, PPP1R3D, र PPP1R3A) जस्ता सुविधाहरूद्वारा संचालित थियो, जुन ग्लाइकोजेन मेटाबोलिज्म (47) (पूरक चित्रहरू 8D–E) लाई नियमन गर्न जानिन्छ। द्रुत फाइबरहरूमा समृद्ध अन्य मार्गहरूमा प्रोटियोममा प्रशोधन (P-) निकायहरू (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (पूरक चित्र 8F), सम्भावित रूपमा पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनमा संलग्न (48), र ट्रान्सक्रिप्टोममा ट्रान्सक्रिप्शन कारक गतिविधि (SREBF1, RXRG, RORA) (पूरक चित्र 8G) समावेश थिए। ढिलो फाइबरहरू अक्सिडोरेडक्टेज गतिविधि (BDH1, DCXR, TXN2) (पूरक चित्र 8H), एमाइड बाइन्डिङ (CPTP, PFDN2, CRYAB) (पूरक चित्र 8I), बाह्य कोशिकीय म्याट्रिक्स (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (पूरक चित्र 8J), र रिसेप्टर-लिग्यान्ड गतिविधि (FNDC5, SPX, NENF) (पूरक चित्र 8K) मा समृद्ध थिए।
ढिलो/छिटो मांसपेशी फाइबर प्रकारका विशेषताहरू अन्तर्निहित ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनमा थप अन्तर्दृष्टि प्राप्त गर्न, हामीले SCENIC49 (पूरक डेटा सेट 14) प्रयोग गरेर ट्रान्सक्रिप्शन कारक संवर्धन विश्लेषण गर्यौं। धेरै ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू छिटो र ढिलो मांसपेशी फाइबरहरू बीच उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थिए (चित्र 4E)। यसमा MAFA जस्ता ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू समावेश थिए, जुन पहिले द्रुत मांसपेशी फाइबर विकाससँग जोडिएको छ,50 साथै धेरै ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू पहिले मांसपेशी फाइबर प्रकार-विशिष्ट जीन कार्यक्रमहरूसँग सम्बन्धित छैनन्। यी मध्ये, PITX1, EGR1, र MYF6 द्रुत मांसपेशी फाइबरहरूमा सबैभन्दा समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू थिए (चित्र 4E)। यसको विपरीत, ZSCAN30 र EPAS1 (HIF2A को रूपमा पनि चिनिन्छ) ढिलो मांसपेशी फाइबरहरूमा सबैभन्दा समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन कारकहरू थिए (चित्र 4E)। यससँग मिल्दोजुल्दो, MAFA द्रुत मांसपेशी फाइबरहरूसँग सम्बन्धित UMAP क्षेत्रमा उच्च स्तरमा व्यक्त गरिएको थियो, जबकि EPAS1 मा विपरीत अभिव्यक्ति ढाँचा थियो (चित्र 4F)।
ज्ञात प्रोटीन-कोडिङ जीनहरूको अतिरिक्त, मानव विकास र रोगको नियमनमा संलग्न हुन सक्ने असंख्य गैर-कोडिङ आरएनए बायोटाइपहरू छन्। 51, 52 ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेटहरूमा, धेरै गैर-कोडिङ आरएनएहरूले फाइबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शन गर्छन् (चित्र 5A र पूरक डेटासेट 15), LINC01405 सहित, जुन ढिलो फाइबरहरूको लागि अत्यधिक विशिष्ट छ र माइटोकोन्ड्रियल मायोप्याथी भएका बिरामीहरूबाट मांसपेशीमा कमी आएको रिपोर्ट गरिएको छ। 53 यसको विपरीत, RP11-255P5.3, lnc-ERCC5-5 जीन (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 सँग सम्बन्धित, द्रुत फाइबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शन गर्दछ। LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) र RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) दुवैले कंकाल मांसपेशी विशिष्टता प्रदर्शन गर्छन् (पूरक चित्रहरू 9A–B) र तिनीहरूको 1 Mb जीनोमिक छिमेक भित्र कुनै ज्ञात संकुचन जीनहरू छैनन्, जसले सुझाव दिन्छ कि तिनीहरूले छिमेकी संकुचन जीनहरूलाई नियमन गर्नुको सट्टा फाइबर प्रकारहरूलाई नियमन गर्नमा विशेष भूमिका खेल्छन्। क्रमशः LINC01405 र RP11-255P5.3 को ढिलो/छिटो फाइबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरू RNAscope (चित्रहरू 5B–C) प्रयोग गरेर पुष्टि गरिएको थियो।
A. नन-कोडिङ RNA ट्रान्सक्रिप्टहरू ढिलो र छिटो-ट्विच मांसपेशी फाइबरहरूमा उल्लेखनीय रूपमा नियमन गरिन्छ। B. LINC01405 र RP11-255P5.3 को ढिलो र छिटो-ट्विच फाइबर प्रकार विशिष्टता देखाउने प्रतिनिधि RNAscope छविहरू, क्रमशः। स्केल बार = 50 μm। C. RNAscope द्वारा निर्धारण गरिएको मायोफाइबर प्रकार-विशिष्ट गैर-कोडिङ RNA अभिव्यक्तिको परिमाणीकरण (n = 3 स्वतन्त्र व्यक्तिहरूबाट बायोप्सीहरू, प्रत्येक व्यक्ति भित्र छिटो र ढिलो मांसपेशी फाइबरहरूको तुलना गर्दै)। दुई-पुच्छर विद्यार्थीको t-परीक्षण प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय विश्लेषण गरिएको थियो। बक्स प्लटहरूले मध्य र पहिलो र तेस्रो चतुर्थकहरू देखाउँछन्, जसमा न्यूनतम र अधिकतम मानहरू औंल्याउने जुँगाहरू छन्। D. डे नोभो माइक्रोबियल प्रोटीन पहिचान कार्यप्रवाह (BioRender.com सँग सिर्जना गरिएको)। E. माइक्रोबियल प्रोटिन LINC01405_ORF408:17441:17358 विशेष रूपमा ढिलो कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा व्यक्त गरिन्छ (स्वतन्त्र सहभागीहरूबाट n=5 बायोप्सीहरू, प्रत्येक सहभागीमा छिटो र ढिलो मांसपेशी फाइबरहरूको तुलना गर्दै)। सांख्यिकीय विश्लेषण लिम रेखीय मोडेल विधि प्रयोग गरेर अनुभवजन्य बायेसियन दृष्टिकोणसँग संयुक्त गरिएको थियो, त्यसपछि p-मान समायोजनको साथ धेरै तुलनाहरूको लागि बेन्जामिनी-होचबर्ग विधि प्रयोग गरिएको थियो। बक्स प्लटहरूले मध्य, पहिलो र तेस्रो चतुर्थकहरू देखाउँछन्, जसमा अधिकतम/न्यूनतम मानहरूलाई औंल्याउने जुँगाहरू छन्।
हालै, अध्ययनहरूले देखाएको छ कि धेरै पुटेटिभ नन-कोडिङ ट्रान्सक्रिप्टहरूले ट्रान्सक्राइब गरिएका माइक्रोबियल प्रोटीनहरूलाई एन्कोड गर्छन्, जसमध्ये केही मांसपेशी कार्यलाई नियमन गर्छन्। ४४, ५५ सम्भावित फाइबर प्रकार विशिष्टता भएका माइक्रोबियल प्रोटीनहरू पहिचान गर्न, हामीले १००० फाइबर ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेट (चित्र ५D) मा फेला परेको गैर-कोडिङ ट्रान्सक्रिप्टहरू (n = ३०५) को अनुक्रमहरू समावेश गर्ने अनुकूलन FASTA फाइल प्रयोग गरेर हाम्रो १००० फाइबर प्रोटीओम डेटासेट खोज्यौं। हामीले २२ फरक ट्रान्सक्रिप्टहरूबाट १९७ माइक्रोबियल प्रोटीनहरू पहिचान गर्यौं, जसमध्ये ७१ ढिलो र छिटो कंकाल मांसपेशी फाइबरहरू बीच भिन्न रूपमा विनियमित थिए (पूरक चित्र ९C र पूरक डेटा सेट १६)। LINC01405 को लागि, तीन माइक्रोबियल प्रोटीन उत्पादनहरू पहिचान गरियो, जसमध्ये एउटाले यसको ट्रान्सक्रिप्टसँग समान ढिलो फाइबर विशिष्टता देखायो (चित्र ५E र पूरक चित्र ९D)। यसरी, हामीले LINC01405 लाई ढिलो कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको लागि विशिष्ट माइक्रोबियल प्रोटीन एन्कोड गर्ने जीनको रूपमा पहिचान गर्यौं।
हामीले व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबरहरूको ठूलो मात्रामा प्रोटियोमिक विशेषता निर्धारण र स्वस्थ अवस्थाहरूमा फाइबर विषमताको पहिचान गरिएका नियामकहरूको लागि एक व्यापक कार्यप्रवाह विकास गर्यौं। हामीले यो कार्यप्रवाहलाई नेमलाइन मायोप्याथीहरूले कंकाल मांसपेशी फाइबर विषमतालाई कसरी असर गर्छ भनेर बुझ्नको लागि लागू गर्यौं। नेमलाइन मायोप्याथीहरू वंशानुगत मांसपेशी रोगहरू हुन् जसले मांसपेशी कमजोरी निम्त्याउँछ र प्रभावित बच्चाहरूमा, श्वासप्रश्वासको समस्या, स्कोलियोसिस, र सीमित अंग गतिशीलता सहित विभिन्न जटिलताहरू हुन्छन्। १९,२० सामान्यतया, नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा, एक्टिन अल्फा १ (ACTA1) जस्ता जीनहरूमा रोगजनक भिन्नताहरूले ढिलो-ट्विच फाइबर मायोफाइबर संरचनाको प्रबलतामा परिणाम दिन्छ, यद्यपि यो प्रभाव विषम छ। एउटा उल्लेखनीय अपवाद ट्रोपोनिन T1 नेमलाइन मायोप्याथी (TNNT1) हो, जसमा द्रुत फाइबरहरूको प्रबलता छ। यसरी, नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा अवलोकन गरिएको कंकाल मांसपेशी फाइबर डिसरेगुलेसनमा अन्तर्निहित विषमताको राम्रो बुझाइले यी रोगहरू र मायोफाइबर प्रकार बीचको जटिल सम्बन्धलाई उजागर गर्न मद्दत गर्न सक्छ।
स्वस्थ नियन्त्रणहरू (प्रति समूह n=३) सँग तुलना गर्दा, ACTA1 र TNNT1 जीनमा उत्परिवर्तन भएका नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूबाट अलग गरिएका मायोफाइबरहरूले चिन्हित मायोफाइबर एट्रोफी वा डिस्ट्रोफी देखाए (चित्र 6A, पूरक तालिका 3)। उपलब्ध सामग्रीको सीमित मात्राको कारणले गर्दा यसले प्रोटियोमिक विश्लेषणको लागि महत्त्वपूर्ण प्राविधिक चुनौतीहरू प्रस्तुत गर्‍यो। यसको बावजुद, हामी 272 कंकाल मायोफाइबरहरूमा 2485 प्रोटीनहरू पत्ता लगाउन सक्षम भयौं। प्रति फाइबर कम्तिमा 1000 परिमाणित प्रोटीनहरूको लागि फिल्टर गरेपछि, 250 फाइबरहरू पछिको बायोइन्फर्मेटिक्स विश्लेषणको अधीनमा थिए। फिल्टर गरेपछि, प्रति फाइबर औसत 1573 ± 359 प्रोटीनहरू परिमाणित गरियो (पूरक चित्र 10A, पूरक डेटा सेटहरू 17-18)। उल्लेखनीय रूपमा, फाइबर आकारमा उल्लेखनीय कमीको बावजुद, नेमलाइन मायोप्याथी बिरामी नमूनाहरूको प्रोटियोम गहिराई केवल मामूली रूपमा घटाइएको थियो। यसबाहेक, हाम्रा आफ्नै FASTA फाइलहरू (नन-कोडिङ ट्रान्सक्रिप्टहरू सहित) प्रयोग गरेर यी डेटा प्रशोधन गर्नाले हामीलाई नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूबाट कंकाल मायोफाइबरहरूमा पाँच माइक्रोबियल प्रोटीनहरू पहिचान गर्न अनुमति दियो (पूरक डेटा सेट १९)। प्रोटीओमको गतिशील दायरा उल्लेखनीय रूपमा फराकिलो थियो, र नियन्त्रण समूहमा कुल प्रोटीनहरू अघिल्लो १०००-फाइबर प्रोटीओम विश्लेषणको नतिजाहरूसँग राम्रोसँग सम्बन्धित थिए (पूरक चित्र १०B-C)।
A. ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी (NM) मा MYH मा आधारित फाइबर एट्रोफी वा डिस्ट्रोफी र विभिन्न फाइबर प्रकारहरूको प्रबलता देखाउने माइक्रोस्कोपिक छविहरू। स्केल बार = १०० μm। ACTA1 र TNNT1 बिरामीहरूमा दाग लाग्ने पुनरुत्पादन क्षमता सुनिश्चित गर्न, प्रतिनिधि छविहरू चयन गर्नु अघि तीन बिरामी बायोप्सीहरू दुई देखि तीन पटक (प्रति केस चार खण्डहरू) दाग लगाइयो। B. MYH मा आधारित सहभागीहरूमा फाइबर प्रकार अनुपात। C. नेमलाइन मायोप्याथी र नियन्त्रण भएका बिरामीहरूमा कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लट। D. नेमलाइन मायोप्याथी र नियन्त्रण भएका बिरामीहरूबाट कंकाल मांसपेशी फाइबरहरू चित्र २ मा विश्लेषण गरिएका १००० फाइबरहरूबाट निर्धारण गरिएको PCA प्लटमा प्रक्षेपित। उदाहरणका लागि, ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी र नियन्त्रणहरू भएका सहभागीहरू बीचको भिन्नताहरू र ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी भएका सहभागीहरू बीचको भिन्नताहरूको तुलना गर्ने ज्वालामुखी प्लटहरू। रंगीन घेराहरूले π < ०.०५ मा उल्लेखनीय रूपमा फरक भएका प्रोटिनहरूलाई जनाउँछ, र गाढा थोप्लाहरूले FDR < ०.०५ मा उल्लेखनीय रूपमा फरक भएका प्रोटिनहरूलाई जनाउँछ। तथ्याङ्कीय विश्लेषण लिम्मा रेखीय मोडेल विधि र अनुभवजन्य बायेसियन विधिहरू प्रयोग गरेर गरिएको थियो, त्यसपछि बेन्जामिनी-होचबर्ग विधि प्रयोग गरेर धेरै तुलनाहरूको लागि p-मान समायोजन गरिएको थियो। H. सम्पूर्ण प्रोटियोम र प्रकार १ र २A फाइबरहरूमा उल्लेखनीय रूपमा भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका प्रोटिनहरूको संवर्धन विश्लेषण। क्लस्टर प्रोफाइलर प्याकेज र बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मानहरू प्रयोग गरेर तथ्याङ्कीय विश्लेषण गरिएको थियो। I, J. प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लटहरू बाह्य कोशिकीय म्याट्रिक्स र माइटोकोन्ड्रियल जीन ओन्टोलोजी (GO) सर्तहरू द्वारा रंगीन।
किनभने नेमलाइन मायोप्याथीहरूले कंकालको मांसपेशीमा MYH-व्यक्त गर्ने मायोफाइबर प्रकारहरूको अनुपातलाई प्रभाव पार्न सक्छ, १९,२० हामीले पहिले नेमलाइन मायोप्याथी र नियन्त्रण भएका बिरामीहरूमा MYH-व्यक्त गर्ने मायोफाइबर प्रकारहरूको जाँच गर्यौं। हामीले १००० मायोफाइबर परख (पूरक चित्र १०D–E) को लागि पहिले वर्णन गरिएको निष्पक्ष विधि प्रयोग गरेर मायोफाइबर प्रकार निर्धारण गर्यौं र फेरि शुद्ध २X मायोफाइबरहरू पहिचान गर्न असफल भयौं (चित्र ६B)। हामीले मायोफाइबर प्रकारमा नेमलाइन मायोप्याथीहरूको विषम प्रभाव अवलोकन गर्यौं, किनकि ACTA1 उत्परिवर्तन भएका दुई बिरामीहरूमा टाइप १ मायोफाइबरहरूको अनुपात बढेको थियो, जबकि TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी भएका दुई बिरामीहरूमा टाइप १ मायोफाइबरहरूको अनुपात घटेको थियो (चित्र ६B)। वास्तवमा, ACTA1-नेमालाइन मायोप्याथीहरूमा MYH2 र द्रुत ट्रोपोनिन आइसोफर्महरू (TNNC2, TNNI2, र TNNT3) को अभिव्यक्ति घटेको थियो, जबकि TNNT1-नेमालाइन मायोप्याथीहरूमा MYH7 अभिव्यक्ति घटेको थियो (पूरक चित्र 11A)। यो नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा विषम मायोफाइबर प्रकार स्विचिंगको अघिल्लो रिपोर्टहरूसँग मेल खान्छ।19,20 हामीले इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीद्वारा यी परिणामहरू पुष्टि गर्यौं र पत्ता लगायौं कि ACTA1-नेमालाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूमा टाइप 1 मायोफाइबरहरूको प्रबलता थियो, जबकि TNNT1-नेमालाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूमा विपरीत ढाँचा थियो (चित्र 6A)।
एकल-फाइबर प्रोटियोम स्तरमा, ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूबाट कंकाल मांसपेशी फाइबरहरू अधिकांश नियन्त्रण फाइबरहरूसँग समूहबद्ध थिए, TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी फाइबरहरू सामान्यतया सबैभन्दा गम्भीर रूपमा प्रभावित हुन्छन् (चित्र 6C)। प्रत्येक बिरामीको लागि छद्म-फुलाइएको फाइबरहरूको प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लटहरू प्लट गर्दा यो विशेष गरी स्पष्ट थियो, TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरू 2 र 3 नियन्त्रण नमूनाहरूबाट सबैभन्दा टाढा देखा परेका थिए (पूरक चित्र 11B, पूरक डेटा सेट 20)। मायोप्याथी बिरामीहरूबाट फाइबरहरू स्वस्थ फाइबरहरूसँग कसरी तुलना गर्छन् भनेर राम्रोसँग बुझ्नको लागि, हामीले स्वस्थ वयस्क सहभागीहरूबाट 1,000 फाइबरहरूको प्रोटियोमिक विश्लेषणबाट प्राप्त विस्तृत जानकारी प्रयोग गर्यौं। हामीले मायोप्याथी डेटासेट (ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरू र नियन्त्रणहरू) बाट फाइबरहरूलाई 1000-फाइबर प्रोटियोमिक विश्लेषण (चित्र 6D) बाट प्राप्त PCA प्लटमा प्रक्षेपण गर्यौं। नियन्त्रण फाइबरहरूमा PC2 सँगसँगै MYH फाइबर प्रकारहरूको वितरण १०००-फाइबर प्रोटोमिक विश्लेषणबाट प्राप्त फाइबर वितरण जस्तै थियो। यद्यपि, नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूमा धेरैजसो फाइबरहरू PC2 तल सरेका थिए, स्वस्थ फास्ट-ट्विच फाइबरहरूसँग ओभरल्याप गर्दै, तिनीहरूको मूल MYH फाइबर प्रकारको पर्वाह नगरी। यसरी, ACTA1 नेमलाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूले MYH-आधारित विधिहरू प्रयोग गरेर परिमाण निर्धारण गर्दा टाइप १ फाइबरतिर परिवर्तन देखाए पनि, ACTA1 नेमलाइन मायोप्याथी र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी दुवैले कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रोटियोमलाई फास्ट-ट्विच फाइबरतिर सारेका थिए।
त्यसपछि हामीले प्रत्येक बिरामी समूहलाई स्वस्थ नियन्त्रणहरूसँग प्रत्यक्ष रूपमा तुलना गर्यौं र ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा क्रमशः २५६ र ५५२ भिन्न रूपमा व्यक्त गरिएका प्रोटीनहरू पहिचान गर्यौं (चित्र ६E–G र पूरक चित्र ११C, पूरक डेटा सेट २१)। जीन संवर्धन विश्लेषणले माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीनहरूमा समन्वित कमी प्रकट गर्‍यो (चित्र ६H–I, पूरक डेटा सेट २२)। आश्चर्यजनक रूपमा, ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा फाइबर प्रकारहरूको भिन्नता प्रबलताको बावजुद, यो कमी MYH-आधारित फाइबर प्रकार (चित्र ६H र पूरक चित्र ११D–I, पूरक डेटा सेट २३) बाट पूर्ण रूपमा स्वतन्त्र थियो। ACTA1 वा TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा तीन माइक्रोबियल प्रोटीनहरू पनि नियमन गरिएका थिए। यी मध्ये दुई माइक्रोप्रोटिनहरू, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (जसलाई LINC00598 वा Lnc-FOXO1 पनि भनिन्छ) र ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) ले टाइप १ मायोफाइबरहरूमा मात्र भिन्नतापूर्ण प्रचुरता देखाए। ENSG00000215483_TR14_ORF67 ले पहिले कोशिका चक्र नियमनमा भूमिका खेल्ने रिपोर्ट गरिएको छ। 56 अर्कोतर्फ, स्वस्थ नियन्त्रणहरूको तुलनामा ACTA1-नेमालाइन मायोप्याथीमा टाइप १ र टाइप २A मायोफाइबरहरूमा ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 सँग मेल खाने) बढाइएको थियो (पूरक चित्र १२A, पूरक डेटा सेट २४)। यसको विपरित, राइबोसोमल प्रोटीनहरू नेमलाइन मायोप्याथीबाट धेरै हदसम्म अप्रभावित थिए, यद्यपि ACTA1 नेमलाइन मायोप्याथी (चित्र 6E) मा RPS17 लाई डाउनरेगुलेट गरिएको थियो।
संवर्धन विश्लेषणले ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा प्रतिरक्षा प्रणाली प्रक्रियाहरूको अपरेगुलेसन पनि प्रकट गर्‍यो, जबकि TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा कोशिका आसंजन पनि बढेको थियो (चित्र 6H)। यी बाह्य कोशिका कारकहरूको संवर्धन बाह्य कोशिका म्याट्रिक्स प्रोटीनहरूले PC1 र PC2 मा PCA लाई नकारात्मक दिशामा (अर्थात्, सबैभन्दा प्रभावित फाइबरहरू तर्फ) सार्दै प्रतिबिम्बित भएको थियो (चित्र 6J)। दुबै बिरामी समूहहरूले प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाहरू र सार्कोलेमल मर्मत संयन्त्रहरूमा संलग्न बाह्य कोशिका प्रोटीनहरूको अभिव्यक्ति बढेको देखाए, जस्तै एनेक्सिन्स (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 र तिनीहरूको अन्तरक्रिया गर्ने प्रोटीन S100A1159 (पूरक चित्र 12B–C)। यो प्रक्रिया पहिले मांसपेशी डिस्ट्रोफीहरूमा बढाइएको रिपोर्ट गरिएको छ60 तर, हाम्रो ज्ञानमा, पहिले नेमलाइन मायोप्याथीसँग सम्बन्धित छैन। चोटपटक पछि सार्कोलेमल मर्मत र मायोफाइबरहरूसँग नयाँ बनेको मायोसाइट्सको फ्यूजनको लागि यस आणविक मेसिनरीको सामान्य कार्य आवश्यक छ58,61। यसरी, दुबै बिरामी समूहहरूमा यस प्रक्रियाको बढ्दो गतिविधिले मायोफाइबर अस्थिरताको कारणले हुने चोटपटकको लागि पुनरुत्थानात्मक प्रतिक्रियाको सुझाव दिन्छ।
प्रत्येक नेमलाइन मायोप्याथीको प्रभाव राम्रोसँग सहसम्बन्धित थियो (r = 0.736) र उचित ओभरल्याप देखायो (पूरक चित्र 11A–B), जसले ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीको प्रोटियोममा समान प्रभाव रहेको संकेत गर्दछ। यद्यपि, केही प्रोटीनहरू ACTA1 वा TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा मात्र नियमन गरिएको थियो (पूरक चित्र 11A र C)। प्रोफिब्रोटिक प्रोटीन MFAP4 TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा सबैभन्दा अपरेगुलेटेड प्रोटीनहरू मध्ये एक थियो तर ACTA1 नेमलाइन मायोप्याथीमा अपरिवर्तित रह्यो। HOX जीन ट्रान्सक्रिप्शनलाई नियमन गर्न जिम्मेवार PAF1C कम्प्लेक्सको एक घटक SKIC8, TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा डाउनरेगुलेट गरिएको थियो तर ACTA1 नेमलाइन मायोप्याथीमा प्रभावित भएन (पूरक चित्र 11A)। ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीको प्रत्यक्ष तुलनाले TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा माइटोकोन्ड्रियल प्रोटीनमा ठूलो कमी र प्रतिरक्षा प्रणाली प्रोटीनमा वृद्धि भएको देखाएको छ (चित्र 6G–H र पूरक चित्रहरू 11C र 11H–I)। यी तथ्याङ्कहरू TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी (चित्र 6A) को तुलनामा TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीमा देखिएको ठूलो शोष/डिस्ट्रोफीसँग मिल्दोजुल्दो छन्, जसले सुझाव दिन्छ कि TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीले रोगको अझ गम्भीर रूपलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ।
नेमलाइन मायोप्याथीको अवलोकन गरिएको प्रभाव सम्पूर्ण मांसपेशी स्तरमा कायम रहन्छ कि रहँदैन भनेर मूल्याङ्कन गर्न, हामीले TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूको एउटै समूहबाट मांसपेशी बायोप्सीको बल्क प्रोटोमिक विश्लेषण गर्यौं र तिनीहरूलाई नियन्त्रणहरूसँग तुलना गर्यौं (n=3 प्रति समूह) (पूरक चित्र १३A, पूरक डेटा सेट २५)। अपेक्षा गरिए अनुसार, नियन्त्रणहरू प्रमुख घटक विश्लेषणमा नजिकबाट सम्बन्धित थिए, जबकि TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी बिरामीहरूले एकल फाइबर विश्लेषणमा देखिने जस्तै उच्च अन्तर-नमूना परिवर्तनशीलता प्रदर्शन गरे (पूरक चित्र १३B)। बल्क विश्लेषणले व्यक्तिगत फाइबरहरूको तुलना गरेर हाइलाइट गरिएको भिन्न रूपमा व्यक्त प्रोटीनहरू (पूरक चित्र १३C, पूरक डेटा सेट २६) र जैविक प्रक्रियाहरू (पूरक चित्र १३D, पूरक डेटा सेट २७) पुनरुत्पादित गर्‍यो, तर विभिन्न फाइबर प्रकारहरू बीच भेद गर्ने क्षमता गुमायो र फाइबरहरूमा विषम रोग प्रभावहरूको लागि खाता बनाउन असफल भयो।
एकसाथ लिँदा, यी तथ्याङ्कहरूले देखाउँछन् कि एकल-मायोफाइबर प्रोटियोमिक्सले क्लिनिकल जैविक विशेषताहरू स्पष्ट पार्न सक्छ जुन इम्युनोब्लोटिंग जस्ता लक्षित विधिहरूद्वारा पत्ता लगाउन सकिँदैन। यसबाहेक, यी तथ्याङ्कहरूले फेनोटाइपिक अनुकूलन वर्णन गर्न एक्टिन फाइबर टाइपिङ (MYH) मात्र प्रयोग गर्ने सीमितताहरूलाई हाइलाइट गर्दछ। वास्तवमा, फाइबर प्रकार स्विचिङ एक्टिन र ट्रोपोनिन नेमलाइन मायोप्याथीहरू बीच फरक भए तापनि, दुवै नेमलाइन मायोप्याथीहरूले MYH फाइबर टाइपिङलाई कंकाल मांसपेशी फाइबर मेटाबोलिज्मबाट छिटो र कम अक्सिडेटिभ मांसपेशी प्रोटियोम तर्फ अलग गर्दछ।
तन्तुहरूको विविध मागहरू पूरा गर्न कोशिका विषमता महत्त्वपूर्ण छ। कंकाल मांसपेशीमा, यसलाई प्रायः बल उत्पादन र थकानका विभिन्न डिग्रीहरूद्वारा विशेषता भएका फाइबर प्रकारहरूको रूपमा वर्णन गरिन्छ। यद्यपि, यो स्पष्ट छ कि यसले कंकाल मांसपेशी फाइबर परिवर्तनशीलताको सानो भाग मात्र व्याख्या गर्दछ, जुन पहिले सोचेको भन्दा धेरै परिवर्तनशील, जटिल र बहुआयामिक छ। प्राविधिक प्रगतिहरूले अब कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूलाई नियमन गर्ने कारकहरूमा प्रकाश पारेको छ। वास्तवमा, हाम्रो डेटाले सुझाव दिन्छ कि प्रकार 2X फाइबरहरू एक विशिष्ट कंकाल मांसपेशी फाइबर उपप्रकार नहुन सक्छ। यसबाहेक, हामीले मेटाबोलिक प्रोटीन, राइबोसोमल प्रोटीन र कोशिका-सम्बन्धित प्रोटीनहरूलाई कंकाल मांसपेशी फाइबर विषमताको प्रमुख निर्धारकको रूपमा पहिचान गर्यौं। नेमाटोड मायोप्याथी भएका बिरामी नमूनाहरूमा हाम्रो प्रोटियोमिक कार्यप्रवाह लागू गरेर, हामीले थप प्रदर्शन गर्यौं कि MYH-आधारित फाइबर टाइपिङले कंकाल मांसपेशी विषमतालाई पूर्ण रूपमा प्रतिबिम्बित गर्दैन, विशेष गरी जब प्रणाली विचलित हुन्छ। वास्तवमा, MYH-आधारित फाइबर प्रकारको पर्वाह नगरी, नेमाटोड मायोप्याथीले छिटो र कम अक्सिडेटिभ फाइबरहरू तर्फ परिवर्तन गर्दछ।
१९ औं शताब्दीदेखि नै कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूलाई वर्गीकृत गरिएको छ। हालैका ओमिक्स विश्लेषणहरूले हामीलाई विभिन्न MYH फाइबर प्रकारहरूको अभिव्यक्ति प्रोफाइलहरू र विभिन्न उत्तेजनाहरूमा तिनीहरूको प्रतिक्रियाहरू बुझ्न सुरु गर्न अनुमति दिएको छ। यहाँ वर्णन गरिएझैं, ओमिक्स दृष्टिकोणहरूमा परम्परागत एन्टिबडी-आधारित विधिहरू भन्दा फाइबर प्रकार मार्करहरूको मात्रा निर्धारण गर्न बढी संवेदनशीलताको फाइदा पनि छ, कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार परिभाषित गर्न एकल (वा केही) मार्करहरूको परिमाणमा भर नपरीकन। हामीले पूरक ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटोमिक कार्यप्रवाहहरू प्रयोग गर्यौं र मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा फाइबर विषमताको ट्रान्सक्रिप्शनल र पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनको जाँच गर्न परिणामहरूलाई एकीकृत गर्यौं। यो कार्यप्रवाहको परिणामस्वरूप हाम्रो स्वस्थ युवा पुरुषहरूको समूहको भास्टस ल्याटरलिसमा प्रोटीन स्तरमा शुद्ध २X-प्रकार फाइबरहरू पहिचान गर्न असफल भयो। यो अघिल्लो एकल फाइबर अध्ययनहरूसँग मेल खान्छ जसले स्वस्थ भास्टस ल्याटरलिसमा <१% शुद्ध २X फाइबरहरू फेला पारेको थियो, यद्यपि यो भविष्यमा अन्य मांसपेशीहरूमा पुष्टि गरिनुपर्छ। mRNA स्तरमा लगभग शुद्ध 2X फाइबर र प्रोटिन स्तरमा केवल मिश्रित 2A/2X फाइबरहरूको पहिचान बीचको भिन्नता अचम्मलाग्दो छ। MYH आइसोफर्म mRNA अभिव्यक्ति सर्काडियन होइन, 67 जसले सुझाव दिन्छ कि हामीले RNA स्तरमा स्पष्ट देखिने शुद्ध 2X फाइबरहरूमा MYH2 सुरुवात संकेत "छुटेको" हुने सम्भावना छैन। एउटा सम्भावित व्याख्या, यद्यपि विशुद्ध रूपमा काल्पनिक, MYH आइसोफर्महरू बीच प्रोटीन र/वा mRNA स्थिरतामा भिन्नता हुन सक्छ। वास्तवमा, कुनै पनि MYH आइसोफर्मको लागि कुनै पनि द्रुत फाइबर १००% शुद्ध हुँदैन, र यो स्पष्ट छैन कि ७०-९०% दायरामा MYH1 mRNA अभिव्यक्ति स्तरले प्रोटीन स्तरमा समान MYH1 र MYH2 प्रशस्ततामा परिणाम दिन्छ कि गर्दैन। यद्यपि, सम्पूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम वा प्रोटियोमलाई विचार गर्दा, क्लस्टर विश्लेषणले तिनीहरूको सटीक MYH संरचनाको पर्वाह नगरी, ढिलो र छिटो कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूको प्रतिनिधित्व गर्ने दुई फरक क्लस्टरहरू मात्र आत्मविश्वासका साथ पहिचान गर्न सक्छ। यो एकल-न्यूक्लियस ट्रान्सक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणहरू प्रयोग गर्ने विश्लेषणहरूसँग मेल खान्छ, जसले सामान्यतया केवल दुई फरक मायोन्यूक्लियर क्लस्टरहरू पहिचान गर्दछ। ६८, ६९, ७० यसबाहेक, अघिल्ला प्रोटोमिक अध्ययनहरूले प्रकार २X फाइबरहरू पहिचान गरेको भए तापनि, यी फाइबरहरू बाँकी द्रुत फाइबरहरूबाट अलग रूपमा क्लस्टर गर्दैनन् र MYH मा आधारित अन्य फाइबर प्रकारहरूको तुलनामा थोरै मात्र भिन्न रूपमा प्रचुर मात्रामा प्रोटीनहरू देखाउँछन्। १४ यी नतिजाहरूले सुझाव दिन्छन् कि हामीले मांसपेशी फाइबर वर्गीकरणको प्रारम्भिक २० औं शताब्दीको दृष्टिकोणमा फर्कनु पर्छ, जसले मानव कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूलाई MYH मा आधारित तीन फरक वर्गहरूमा होइन, तर तिनीहरूको चयापचय र संकुचन गुणहरूको आधारमा दुई क्लस्टरहरूमा विभाजित गर्‍यो। ६३
अझ महत्त्वपूर्ण कुरा, मायोफाइबर विषमतालाई बहुआयामहरूमा विचार गर्नुपर्छ। अघिल्ला "ओमिक्स" अध्ययनहरूले यस दिशामा औंल्याएका छन्, जसले सुझाव दिन्छ कि कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूले अलग समूहहरू बनाउँदैनन् तर निरन्तरतामा व्यवस्थित हुन्छन्। ११, १३, १४, ६४, ७१ यहाँ, हामी देखाउँछौं कि, कंकाल मांसपेशीको संकुचन र चयापचय गुणहरूमा भिन्नताहरूको अतिरिक्त, मायोफाइबरहरूलाई सेल-सेल अन्तरक्रिया र अनुवाद संयन्त्रहरूसँग सम्बन्धित सुविधाहरूद्वारा छुट्याउन सकिन्छ। वास्तवमा, हामीले कंकाल मांसपेशी फाइबरहरूमा राइबोसोम विषमता फेला पार्यौं जसले ढिलो र छिटो फाइबर प्रकारहरूबाट स्वतन्त्र विषमतामा योगदान पुर्‍याउँछ। ढिलो र छिटो फाइबर प्रकारबाट स्वतन्त्र, यो पर्याप्त मायोफाइबर विषमताको आधारभूत कारण अस्पष्ट रहन्छ, तर यसले मांसपेशी फासिकलहरू भित्र विशेष स्थानिय संगठनलाई संकेत गर्न सक्छ जसले विशिष्ट बलहरू र भारहरूलाई इष्टतम रूपमा प्रतिक्रिया दिन्छ, ७२ मांसपेशी सूक्ष्म वातावरणमा अन्य कोशिका प्रकारहरूसँग विशेष सेलुलर वा अंग-विशिष्ट सञ्चार ७३,७४,७५ वा व्यक्तिगत मायोफाइबर भित्र राइबोसोम गतिविधिमा भिन्नताहरू। वास्तवमा, RPL3 र RPL3L को प्यारालोगस प्रतिस्थापन मार्फत वा rRNA को 2′O-मिथाइलेशनको स्तरमा, राइबोसोमल हेटेरोप्लाज्मीलाई कंकाल मांसपेशी हाइपरट्रोफीसँग सम्बन्धित देखाइएको छ76,77। व्यक्तिगत मायोफाइबरहरूको कार्यात्मक विशेषतासँग मिलेर बहु-ओमिक र स्थानिक अनुप्रयोगहरूले बहु-ओमिक स्तरमा मांसपेशी जीवविज्ञानको हाम्रो बुझाइलाई अझ अगाडि बढाउनेछ78।
नेमलाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूबाट एकल मायोफाइबरको प्रोटियोमहरूको विश्लेषण गरेर, हामीले कंकाल मांसपेशीको क्लिनिकल प्याथोफिजियोलोजीलाई स्पष्ट पार्न एकल मायोफाइबर प्रोटियोमिक्सको उपयोगिता, प्रभावकारिता र प्रयोज्यता पनि प्रदर्शन गर्यौं। यसबाहेक, हाम्रो कार्यप्रवाहलाई विश्वव्यापी प्रोटियोमिक विश्लेषणसँग तुलना गरेर, हामीले प्रदर्शन गर्न सक्षम भयौं कि एकल मायोफाइबर प्रोटियोमिक्सले विश्वव्यापी टिस्यु प्रोटियोमिक्स जस्तै जानकारीको गहिराइ दिन्छ र इन्टरफाइबर विषमता र मायोफाइबर प्रकारको लागि लेखांकन गरेर यो गहिराइ विस्तार गर्दछ। स्वस्थ नियन्त्रणहरूको तुलनामा ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा अवलोकन गरिएको फाइबर प्रकार अनुपातमा अपेक्षित (चर भए पनि) भिन्नताहरूको अतिरिक्त, 19 हामीले MYH-मध्यस्थ फाइबर प्रकार स्विचिंगबाट स्वतन्त्र अक्सिडेटिभ र बाह्य कोशिकीय पुनर्निर्माण पनि अवलोकन गर्यौं। TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथीहरूमा फाइब्रोसिस पहिले नै रिपोर्ट गरिएको छ।19 यद्यपि, हाम्रो विश्लेषणले ACTA1 र TNNT1 नेमलाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूबाट मायोफाइबरहरूमा सार्कोलेमल मर्मत संयन्त्रमा संलग्न एनेक्सिन जस्ता बाह्य कोशिकीय स्रावित तनाव-सम्बन्धित प्रोटीनहरूको बढ्दो स्तर पनि प्रकट गरेर यस खोजमा आधारित छ।57,58,59 निष्कर्षमा, नेमलाइन मायोप्याथी भएका बिरामीहरूबाट मायोफाइबरहरूमा बढेको एनेक्सिन स्तरले गम्भीर रूपमा एट्रोफिक मायोफाइबरहरू मर्मत गर्न सेलुलर प्रतिक्रिया प्रतिनिधित्व गर्न सक्छ।
यद्यपि यो अध्ययनले आजसम्मको मानवको सबैभन्दा ठूलो एकल-फाइबर सम्पूर्ण-मांसपेशी-ओमिक्स विश्लेषणको प्रतिनिधित्व गर्दछ, यो सीमितता बिना छैन। हामीले सहभागीहरूको अपेक्षाकृत सानो र एकरूप नमूना र एकल मांसपेशी (भास्टस लेटरलिस) बाट कंकाल मांसपेशी फाइबरहरू अलग गर्यौं। त्यसकारण, मांसपेशी प्रकारहरूमा र मांसपेशी शरीरविज्ञानको चरम सीमाहरूमा विशिष्ट फाइबर जनसंख्याको अस्तित्वलाई बहिष्कार गर्न असम्भव छ। उदाहरणका लागि, हामी उच्च प्रशिक्षित स्प्रिन्टरहरू र/वा बलियो खेलाडीहरूमा वा मांसपेशी निष्क्रियताको अवधिमा अल्ट्राफास्ट फाइबरहरू (जस्तै, शुद्ध 2X फाइबर) को उपसमूह देखा पर्ने सम्भावनालाई बहिष्कार गर्न सक्दैनौं79। यसबाहेक, सहभागीहरूको सीमित नमूना आकारले हामीलाई फाइबर विषमतामा लिङ्ग भिन्नताहरूको अनुसन्धान गर्नबाट रोकेको थियो, किनकि फाइबर प्रकार अनुपात पुरुष र महिलाहरू बीच फरक हुने ज्ञात छ। यसबाहेक, हामी एउटै मांसपेशी फाइबर वा एउटै सहभागीहरूबाट नमूनाहरूमा ट्रान्सक्रिप्टोमिक र प्रोटियोमिक विश्लेषणहरू सञ्चालन गर्न असमर्थ थियौं। हामी र अरूले अल्ट्रा-लो नमूना इनपुट (यहाँ माइटोकोन्ड्रियल मायोप्याथी भएका बिरामीहरूबाट फाइबरको विश्लेषणमा देखाइएझैं) प्राप्त गर्न ओमिक्स विश्लेषण प्रयोग गरेर एकल-कोशिका र एकल-मायोफाइबर विश्लेषणहरूलाई अनुकूलन गर्न जारी राख्दा, एकल मांसपेशी फाइबर भित्र बहु-ओमिक्स (र कार्यात्मक) दृष्टिकोणहरू संयोजन गर्ने अवसर स्पष्ट हुन्छ।
समग्रमा, हाम्रो डेटाले कंकाल मांसपेशी विषमताको ट्रान्सक्रिप्शनल र पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल चालकहरूलाई पहिचान र व्याख्या गर्दछ। विशेष गरी, हामी फाइबर प्रकारहरूको शास्त्रीय MYH-आधारित परिभाषासँग सम्बन्धित कंकाल मांसपेशी शरीर विज्ञानमा लामो समयदेखि चलिरहेको सिद्धान्तलाई चुनौती दिने डेटा प्रस्तुत गर्दछौं। हामी बहसलाई नवीकरण गर्ने र अन्ततः कंकाल मांसपेशी फाइबर वर्गीकरण र विषमताको हाम्रो बुझाइमा पुनर्विचार गर्ने आशा गर्दछौं।
चौध जना कोकेशियन सहभागीहरू (१२ पुरुष र २ महिला) स्वेच्छाले यस अध्ययनमा भाग लिन सहमत भए। अध्ययनलाई गेन्ट विश्वविद्यालय अस्पतालको नैतिक समिति (BC-10237) द्वारा अनुमोदन गरिएको थियो, २०१३ हेलसिंकी घोषणापत्रको पालना गरिएको थियो, र ClinicalTrials.gov (NCT05131555) मा दर्ता गरिएको थियो। सहभागीहरूको सामान्य विशेषताहरू पूरक तालिका १ मा प्रस्तुत गरिएको छ। मौखिक र लिखित सूचित सहमति प्राप्त गरेपछि, अध्ययनमा अन्तिम समावेश गर्नु अघि सहभागीहरूले एक चिकित्सा परीक्षण गराए। सहभागीहरू युवा (२२-४२ वर्ष), स्वस्थ (कुनै चिकित्सा अवस्था छैन, धूम्रपानको इतिहास छैन), र मध्यम शारीरिक रूपमा सक्रिय थिए। पहिले वर्णन गरिए अनुसार शारीरिक फिटनेस मूल्याङ्कन गर्न स्टेप एर्गोमिटर प्रयोग गरेर अधिकतम अक्सिजन अपटेक निर्धारण गरिएको थियो। ८१
मांसपेशी बायोप्सी नमूनाहरू आराम गर्दा र उपवास अवस्थामा तीन पटक, १४ दिनको अन्तरालमा सङ्कलन गरिएको थियो। यी नमूनाहरू ठूलो अध्ययनको भागको रूपमा सङ्कलन गरिएको हुनाले, सहभागीहरूले बायोप्सीभन्दा ४० मिनेट अघि प्लेसबो (ल्याक्टोज), H1-रिसेप्टर विरोधी (५४० मिलीग्राम फेक्सोफेनाडाइन), वा H2-रिसेप्टर विरोधी (४० मिलीग्राम फेमोटिडाइन) सेवन गरे। हामीले पहिले नै प्रदर्शन गरिसकेका छौं कि यी हिस्टामाइन रिसेप्टर विरोधीहरूले आराम गर्ने कंकाल मांसपेशी फिटनेसलाई असर गर्दैनन्81, र हाम्रो गुणस्तर नियन्त्रण प्लटहरूमा कुनै पनि राज्य-सम्बन्धित क्लस्टरिङ अवलोकन गरिएको थिएन (पूरक चित्र ३ र ६)। प्रत्येक प्रयोगात्मक दिनको ४८ घण्टा अघि एक मानकीकृत आहार (४१.४ किलो क्यालोरी/किग्रा शरीरको तौल, ५.१ ग्राम/किग्रा शरीरको तौल कार्बोहाइड्रेट, १.४ ग्राम/किग्रा शरीरको तौल प्रोटीन, र १.६ ग्राम/किग्रा शरीरको तौल बोसो) कायम राखिएको थियो, र प्रयोगात्मक दिनको बिहान एक मानकीकृत नास्ता (१.५ ग्राम/किग्रा शरीरको तौल कार्बोहाइड्रेट) खपत गरिएको थियो। स्थानीय एनेस्थेसिया (एपिनेफ्रिन बिना ०.५ मिली १% लिडोकेन) अन्तर्गत, पर्कुटेनियस बर्गस्ट्रोम एस्पिरेशन प्रयोग गरेर भास्टस ल्याटरलिस मांसपेशीबाट मांसपेशी बायोप्सी प्राप्त गरियो।82 मांसपेशीका नमूनाहरू तुरुन्तै RNAlater मा इम्बेड गरियो र म्यानुअल फाइबर विच्छेदन (३ दिन सम्म) सम्म ४°C मा भण्डारण गरियो।
ताजा पृथक मायोफाइबर बन्डलहरूलाई कल्चर डिशमा ताजा आरएनएलेटर माध्यममा स्थानान्तरण गरियो। त्यसपछि व्यक्तिगत मायोफाइबरहरूलाई स्टेरियोमाइक्रोस्कोप र फाइन ट्वीजर प्रयोग गरेर म्यानुअल रूपमा विच्छेदन गरियो। बायोप्सीको विभिन्न क्षेत्रहरूबाट फाइबरहरू चयन गर्न विशेष ध्यान दिँदै प्रत्येक बायोप्सीबाट पच्चीस फाइबरहरू विच्छेदन गरियो। विच्छेदन पछि, प्रत्येक फाइबरलाई अनावश्यक प्रोटीन र डीएनए हटाउन प्रोटीनेज के र डीएनएज इन्जाइमहरू भएको ३ μl लिसिस बफर (सिंगलशट सेल लाइसिस किट, बायो-रेड) मा बिस्तारै डुबाइयो। त्यसपछि सेल लिसिस र प्रोटीन/डीएनए हटाउने काम छोटो भोर्टेक्सिङ, माइक्रोसेन्ट्रीफ्यूजमा तरल पदार्थ घुमाएर र कोठाको तापक्रम (१० मिनेट) मा इन्क्युबेशनद्वारा सुरु गरियो। त्यसपछि लाइसेटलाई थर्मल साइकलर (T100, बायो-रेड) मा ३७°C मा ५ मिनेटको लागि, ७५°C मा ५ मिनेटको लागि, र त्यसपछि तुरुन्तै -८०°C मा थप प्रशोधन नभएसम्म भण्डारण गरियो।
इलुमिना-कम्प्याटिबल पोलिएडेनिलेटेड आरएनए लाइब्रेरीहरू क्वान्टसेक-पूल ३′ एमआरएनए-सेक लाइब्रेरी प्रेप किट (लेक्सोजेन) प्रयोग गरेर २ µl मायोफाइबर लाइसेटबाट तयार पारिएको थियो। विस्तृत विधिहरू निर्माताको म्यानुअलमा फेला पार्न सकिन्छ। प्रक्रिया रिभर्स ट्रान्सक्रिप्शनद्वारा पहिलो-स्ट्र्यान्ड cDNA संश्लेषणबाट सुरु हुन्छ, जसको क्रममा नमूनाहरूको पूलिंग सुनिश्चित गर्न र डाउनस्ट्रीम प्रशोधनको क्रममा प्राविधिक परिवर्तनशीलता कम गर्न अद्वितीय आणविक पहिचानकर्ताहरू (UMIs) र नमूना-विशिष्ट i1 बारकोडहरू प्रस्तुत गरिन्छ। त्यसपछि ९६ मायोफाइबरहरूबाट cDNA लाई चुम्बकीय मोतीहरूद्वारा पूल र शुद्ध गरिन्छ, त्यसपछि RNA हटाइन्छ र अनियमित प्राइमरहरू प्रयोग गरेर दोस्रो-स्ट्र्यान्ड संश्लेषण गरिन्छ। पुस्तकालयलाई चुम्बकीय मोतीहरूद्वारा शुद्ध गरिन्छ, पूल-विशिष्ट i5/i7 ट्यागहरू थपिन्छन्, र PCR प्रवर्द्धित गरिन्छ। अन्तिम शुद्धिकरण चरणले इलुमिना-कम्प्याटिबल पुस्तकालयहरू उत्पादन गर्दछ। प्रत्येक पुस्तकालय पूलको गुणस्तर उच्च संवेदनशीलता सानो खण्ड DNA विश्लेषण किट (Agilent Technologies, DNF-477-0500) प्रयोग गरेर मूल्याङ्कन गरिएको थियो।
क्युबिट परिमाणीकरणको आधारमा, पूलहरूलाई समतुल्य सांद्रता (२ nM) मा थप पूल गरियो। त्यसपछि परिणामस्वरूप पूललाई ​​NovaSeq S2 अभिकर्मक किट (१ × १०० न्यूक्लियोटाइडहरू) प्रयोग गरेर २ nM लोडिङ (४% PhiX) प्रयोग गरेर मानक मोडमा NovaSeq ६००० उपकरणमा अनुक्रमित गरियो।
हाम्रो पाइपलाइन लेक्सोजेनको क्वान्टसेक पूल डेटा विश्लेषण पाइपलाइन (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) मा आधारित छ। i7/i5 अनुक्रमणिकाको आधारमा bcl2fastq2 (v2.20.0) सँग डेटा पहिले डिमल्टीप्लेक्स गरिएको थियो। त्यसपछि i1 नमूना बारकोडको आधारमा idemux (v0.1.6) सँग रिड २ लाई डिमल्टीप्लेक्स गरिएको थियो र umi_tools (v1.0.1) सँग UMI अनुक्रमहरू निकालिएको थियो। त्यसपछि छोटो पठनहरू (<20 लम्बाइमा) वा केवल एडाप्टर अनुक्रमहरू समावेश गर्ने पठनहरू हटाउन धेरै राउन्डहरूमा कटएडाप्ट (v3.4) सँग रिडहरू ट्रिम गरिएको थियो। त्यसपछि STAR (v2.6.0c) प्रयोग गरेर मानव जीनोममा रिडहरू पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो र BAM फाइलहरू SAMtools (v1.11) सँग अनुक्रमित गरिएको थियो। डुप्लिकेट पठनहरू umi_tools (v1.0.1) प्रयोग गरेर हटाइयो। अन्तमा, सबरीड (v2.0.3) मा फिचरकाउन्टहरू प्रयोग गरेर पङ्क्तिबद्धता गणना गरिएको थियो। पाइपलाइनको धेरै मध्यवर्ती चरणहरूमा FastQC (v0.11.9) प्रयोग गरेर गुणस्तर नियन्त्रण गरिएको थियो।
सबै थप बायोइन्फर्मेटिक्स प्रशोधन र दृश्यीकरण R (v4.2.3) मा गरिएको थियो, मुख्यतया Seurat (v4.4.0) कार्यप्रवाह प्रयोग गरेर। 83 त्यसकारण, व्यक्तिगत UMI मानहरू र मेटाडेटा म्याट्रिक्सहरू Seurat वस्तुहरूमा रूपान्तरण गरियो। सबै फाइबरहरूको 30% भन्दा कममा व्यक्त गरिएका जीनहरू हटाइए। न्यूनतम 1000 UMI मानहरू र 1000 पत्ता लगाइएका जीनहरूको आधारमा कम-गुणस्तरका नमूनाहरू हटाइए। अन्ततः, 925 फाइबरहरूले सबै गुणस्तर नियन्त्रण फिल्टरिङ चरणहरू पार गरे। UMI मानहरू Seurat SCTransform v2 विधि प्रयोग गरेर सामान्यीकृत गरियो, 84 ले सबै 7418 पत्ता लगाइएका सुविधाहरू सहित, र सहभागीहरू बीचको भिन्नताहरू फिर्ता गरियो। सबै सान्दर्भिक मेटाडेटा पूरक डेटासेट 28 मा फेला पार्न सकिन्छ।